【水产】扒一扒影响PCR扩增的抑制物

2024-12-06
PCR技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异DNA片段的技术。一个PCR反应过程分为很多的步骤，同时也受到很多因素的影响。当确认反应中其他组分没有问题的情况下，例如已添加了适当浓度的PCR试剂（引物、dNTP、Mg2+、Taq聚合酶等），但PCR反应仍不理想，扩增效率低，则反应中很可能存在抑制成分。

一、PCR反应中抑制物来源

PCR抑制物是指那些能够干扰或阻止PCR反应正常进行的物质。PCR抑制物来源包含内源性（来源于样本组成成分）和外源性（样本采集或核酸提取过程中引入）。

1、内源性抑制物

PCR抑制物存在于水生动物及其养殖环境中。虾/鱼组织、塘泥、养殖用水、粪便含有的几种可能影响PCR扩增的物质，例如：

  • 未纯化好DNA模板：DNA模板中残留有机化合物、蛋白质、脂类等杂质，这些杂质可能会直接或间接地抑制PCR反应。

  • 土壤抑制物：塘泥可能含有腐殖酸和硫胺酸等有机物质，即使是很低量的情况下也会抑制PCR；当使用生石灰消毒时，若从塘泥样品中提取出来的核酸纯度过低，高浓度的钙离子可能会与反应中的镁离子竞争性与DNA聚合酶结合，PH过高也可能会抑制PCR反应；污泥中存在的脂肪、蛋白质、多酚和重金属、多糖、金属离子和核糖核酸酶。

  • 水中抑制物：如井水可能含重金属、多糖、金属离子（如铁离子）；废水中存在的脂肪、蛋白质、多酚和重金属、多糖、金属离子和核糖核酸酶等环境样本的常见PCR抑制物。

  • 虾粪便抑制物：钙质（如碳酸钙）、壳质（一种类似纤维素的聚合物）等。

2、外源性抑制物

  • 过度紫外照射的矿物油，手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。

  • 有效的细胞裂解或核酸提取中使用的几种物质在某些浓度下可能会抑制PCR反应，例如：盐（NaCl或KCl）、离子洗涤剂、非离子洗涤剂或有机分子（EDTA、乙醇、异丙醇或苯酚）。

  • 离子洗涤剂（如脱氧胆酸钠、沙可辛和SDS）对PCR具有高度抑制作用，而非离子洗涤剂（例如Nonidet P-40   、Tween 20、Triton X-100和N-辛基葡萄糖苷）仅在相对较高的浓度下引起PCR抑制。

二、PCR抑制物的抑制原理   

PCR反应性能的有效性可能受到不同抑制物在不同阶段干扰的影响。图1显示了主要的几种抑制原理：

【1、抑制物结合核酸模板（图1A）】在核酸纯化过程中通过直接与单链或双链核酸结合而躲避清除。例如，核酸酶可以修饰或降解模板RNA或DNA，酚类可以在氧化条件下交联RNA，从而阻碍RNA分离。此外，多糖的存在可能会降低再悬浮沉淀RNA的能力。这些核酸提取的残留抑制物会与核酸结合而影响模板与聚合酶的结合。

【2、抑制PCR反应中的辅助因子与聚合酶的结合（图1B）】例如高浓度的钙离子可能会与反应中的镁离子竞争性与DNA聚合酶结合；某些螯合剂，如单宁酸，会结合镁离子。这两种情况下，镁不再作为聚合酶的辅因子，因此酶活性被降低。
【3、DNA聚合酶被抑制物降解、阻断或改变（图1B）】例如，反应中存在的蛋白酶或洗涤剂、尿素和苯酚可以降解这种酶。钙、胶原蛋白、血红素和单宁酸可能会抑制聚合酶活性。黑色素与DNA聚合酶形成可逆复合物，多糖可能通过模仿核酸的结构来干扰酶过程。腐殖酸与模板DNA和聚合酶相互作用，因此即使在低浓度下也会阻止酶反应。
【4、抑制引物与模板结合（图1C）】 某些PCR抑制物可能会阻碍引物与DNA模板的退火，由于这种效应是由抑制剂与模板的竞争性结合引起的，可以通过适当的底物设计来克服这个问题，从而获得更高的熔点。

【5、抑制逆转录酶（图1D）】某些抑制物通过直接与逆转录酶结合来抑制逆转录，导致其变性，或与DNA新生链结合，导致转录提前终止。例如，黑色素通过与酶的直接相互作用抑制逆转录。

【6、干扰探针（图1E）】通过对荧光探针的干扰或增加背景荧光降低扩增效率。

图1.样品制备和PCR过程中PCR抑制作用。A）在核酸纯化过程中，抑制物与双链或单链核酸反应并共提纯; B）降低Mg2+和其他聚合酶辅因子的可用性，从而干扰DNA活性; C）干扰引物退火; D）与逆转录酶结合或与DNA链结合并终止它。E）阻止荧光团与新生DNA结合。

三、PCR抑制物的去除   

一般来说，可以通过使用适当的样品处理和核酸提取方法、选择更强大的DNA聚合酶来降低PUC抑制物（指能抑制特定酶或蛋白质活性的小分子或化合物）的影响。

【1、降低核酸提取中的抑制物残留 】
减少取样量重新提取、稀释样品或提取的核酸，可降低模板中的PCR抑制物，这是简单的降低抑制的方法，但是缺点是由于稀释了模板，同时也有可能影响检测灵敏度。
【2、提高核酸纯度】

如通过适当增加裂解时间、漂洗次数等方法来获得纯度更高的核酸。

【3、通过选择更高效的DNA聚合酶】

DNA聚合酶可以被生物样本中存在的各种化合物降解、变性或降低酶活性。针对检测样品选择合适的DNA酶或预混液，可以有效提高扩增效率，降低抑制作用。例如，Tth聚合酶（提取自嗜热栖热菌）和 Tfl聚合酶（提取自黄栖热杆菌）比常用的Taq聚合酶对血液的抵抗力要强。通过定点突变工程化的Taq聚合酶，增强了对血液和土壤中抑制剂的抵抗力，并提高了对高浓度DNA结合染料的耐受性。例如，Taq聚合酶的突变体对引物模板具有更高的亲和力（突变体的Kd为1.1 nM，野生型Taq为102 nM）。

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来源 | 综合整理

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